摘要

   血管性認知功能障礙（Vascular Cognitive Impairment，VCI)是di二大常見 的認知功能障礙，約占所有癡呆的20%，其中，腦白質損傷，即髓鞘或少突膠質細胞 (Oligodendrocytes，OLs)損傷是VCI重要的病理改變。近年來中樞神經系統炎癥細 胞棗小膠質細胞激活與白質損傷的關系備受關注。我們前期在VCI動物模型中發 現，VCI小鼠髓鞘受損、小膠質細胞大量激活。同時，缺血引起小膠質細胞 Fractalkine/CX3CR1通路激活、CX3CR1表達上調，其下游核轉錄因子kB-_P50/65 (Nuclear Factor- Kappa B, NF-kB)表達升高使小膠質細胞釋放更多促炎因子，并導 致認知功能障礙。因此我們提出通過調控CX3CR1相關信號通路調控小膠質細胞激 活、減輕炎癥反應，從而保護OLs、促進少突膠質細胞前體細胞（Oligodendrocyte Prescusor Cells, OPCs)成熟分化修復髓鞘并改善VCI認知功能。

   本課題米用雙側頸總動脈結扎（Bilateral Common Carotid Artery Occlusion， BCCAO)術構建VCI模型，分別對CX3CR1及其通路下游關鍵因子NF-kB與非受 體型酪氨酸蛋白激酶Src進行拮抗。通過懸尾不動實驗（Tail Suspension Test，TST) 與強迫游泳實驗（Forced Swimming Test，FST)觀察藥物抗抑郁作用；Morris水迷宮 (Morris Water Maze，MWM)觀察動物海馬相關學習記憶功能改善情況。采用酶聯 免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)檢測外周血清中炎癥因子 與髓鞘相關蛋白含量，堅牢藍（Luxol Fast Blue，LFB)染色以及免疫組織化學染色 標記髓鞘堿性蛋白(Myelin Basic Protein，MBP)分別觀察胼胝體（Corpus Callosum, CC) 與海馬區髓鞘損傷與修復情況，免疫組織化學法標記離子鈣接頭蛋白抗原（Ionized Calcium Binding Adapter Molecule 1，Iba-1)、神經膠質細胞抗原（Neuron-glial Antigen 2，NG2)、04與神經元核抗原（Neuronal Nuclei, Neun)觀察海馬激活小膠質細胞、 OPCs、成熟前OLs與神經元數量。采用蛋白質免疫印跡（Western Blot, WB)法對海 馬區MBP含量進行檢測。

   第yi部分研究表明，CX3CR1中和抗體anti-FKR干預后，VCI小鼠TST與FST不動時間明顯縮短；MWM隱蔽站臺實驗第4天找到站臺潛伏期時間明顯縮短，空間 探索實驗穿越目標象限的次數、在目標象限停留的時間以及在目標象限游動的路程占 總游動路程百分比均較VCI+NS組明顯增加，提示拮抗CX3CR1明顯改善VCI小鼠 抑郁行為與海馬相關學習記憶功能。CC區LFB與免疫組織化學MBP染色相應IOD 值差異不具有統計學意義，而海馬區免疫組化MBP染色以及WB分析MBP相應IOD 值明顯升高，外周血清MOG含量下降，提示拮抗CX3CR1能保護海馬區髓鞘并促進 髓鞘修復。拮抗CX3CR1后，海馬區Iba-1陽性細胞數目明顯減少，同時ELISA結 果顯示VCI+anti-FKR組IL-ip與TNF-a含量較VCI+NS組明顯降低，表明拮抗CX3CR1能抑制小膠質細胞激活并減輕VCI小鼠炎癥反應。此外，anti-FKR稍減少 海馬區NG2陽性細胞數并明顯增加04與Nerni陽性細胞數，提示拮抗CX3CR1能促 進海馬區OPCs成熟分化、修復受損髓鞘，并保護神經元。

    第二部分研究表明，NF-kB拮抗劑PDTC干預后，VCI小鼠TST與FST不動時 間明顯縮短，而Src拮抗劑PP2上述作用并不明顯。VCI+PDTC小鼠MWM隱蔽站 臺實驗第4天找到站臺潛伏期、空間探索實驗游動速度、穿越平臺次數、在平臺象限 停留時間、路程差異均不具有統計學意義，而VCI+PP2小鼠在隱蔽站臺實驗找到站 臺潛伏期時間明顯縮短，空間探索實驗穿越目標象限的次數與在目標象限游動的路 程占總游動路程百分比均較VCI+NS組明顯增加。拮抗NF-kB與Src蛋白后，CC區 LFB與MBP染色相應:[OD值比較結果顯示差異均不具有統計學意義。使用PP2能 明顯增加海馬區MBP免疫組織化學染色IOD值，并減少外周血中MOG含量，提示 拮抗Src能保護海馬區髓鞘并促進修復。與VCI+NS組相比，PDTC+NS組小鼠海馬 區Iba-1陽性細胞數明顯減少，血清ELISA中IL-6、TNF-a、HMGB1含量明顯降低， 提示拮抗NF-kB能抑制內源性小膠質細胞激活并減輕炎癥反應。與VCI+NS組相比， PP2+NS組小鼠海馬區04陽性細胞數明顯增加、NG2陽性細胞數稍有減少而Iba-1 與Neun陽性細胞數沒有明顯差異。提示拮抗Src能促進海馬區OPCs成熟分化修復 髓鞘。

上述實驗結果表明，CX3CR1中和抗體anti-FKR通過抑制CX3CR1通路能有效

   抑制VCI小鼠小膠質細胞激活并控制炎癥反應、保護海馬區神經元、促進海馬區OPCs 成熟分化并修復髓鞘，從而改善缺血小鼠認知功能障礙。NF-kB抑制劑PDTC能減 少VCI動物在缺血缺氧時引起的小膠質細胞激活、緩解炎癥，而Src抑制劑PP2能 減少VCI小鼠缺血缺氧時髓鞘的損傷并促進OPCs成熟分化、髓鞘修復，從而分別改 善VCI小鼠的抑郁與認知功能障礙。因此，調控CX3CR1下游的Src和域NF-kB的 作用可能是未來預防與治療VCI潛在的重要靶點。

關鍵詞_：血管性認知功能障礙，髓鞘，少突膠質細胞，小膠質細胞， Fractalkine/CX3CR1 通路